Этапы лабораторной диагностики вирусных болезней. Устройство вирусологической лаборатории.
1) Индикация (обнаружение) вируса в патматериале:
Экспресс-методы:
a) Обнаружение вирионов:
(1) Электронной микроскопией;
(2) Световой микроскопией (оспа);
b) Обнаружение вирусных АГ в серологических реакциях (РИФ, ИФА, РСК, РДП, РНГА);
c) Обнаружение телец-включений методами световой и люминесцентной микроскопии;
d) Обнаружение вирусных нуклеиновых кислот методами ПЦР, ДНК-зондов;
e) Обнаружение гемагглютининов в РГА;
f) Обнаружение инфекционной активности вируса в биопробе.
2) Изоляция (выделение) вируса из патматериала. Изоляцию проводят независимо от результатов первого этапа методом биологической пробы в трёх «слепых» пассажах. Пассаж – это заражение живой системы, с целью получения новой популяции вируса. «Слепой» пассаж – заражение без видимых признаков репродукции вируса. Через три пассажа в клетках живой системы происходит накопление вируса, что сопровождается появлением признаков репродукции, видимых на уровне макроорганизма. Например, при биопробе на животных : клинические признаки, гибель, патизменения; на куриных эмбрионах – гибель, патизменения, гемагглютинация; на культуре клеток – ЦПД, гемадсорбция, бляшки, РИФ и др. Такие зараженные живые системы определяют как положительная биопроба. Однако точно установить вид инфекционного агента еще нельзя. Поэтому от положительной биопробы отбирают патологический материал, который условно считают вторичным, т.е. отобранным из живой системы с признаками положительной биопробы. Из него готовят вируссодержащую суспензию или мазки-отпечатки (выделенный вирус).
3) Идентификация (определение вида) выделенного вируса в серологических реакциях или методом ПЦР-анализа. В редких случаях возможна идентификация по другим признакам, например по внутриклеточным включениям (тельца Бабеша-Негри для бешенства).
4) При необходимости – доказательство этиологической роли выделенного вируса. Для этого применяют серологические реакции, в которых в качестве антигена используют выделенный вирус и в качестве антител – парные пробы сыворотки крови в двукратных последовательных разведениях. Положительным результатом, доказывающим этиологическую роль выделенного вируса, является увеличение титра антител во второй пробе сыворотки крови по сравнению с первой в 4 и более раз.
5) Ретроспективная диагностика. С этой целью используют парные сыворотки крови, взятые на этапе выздоровления, которые исследуют в серологических реакциях со стандартным специфическим антигеном в соответствии с предварительным диагнозом на вирусную болезнь. Нарастание в 4 и более раз титра антител во второй пробе по сравнению с первой свидетельствует об активном инфекционном процессе, протекающем в организме животного в период взятия у него крови. При этом болезнь вызвана тем вирусом, к которому установлено повышение титра антител в парных сыворотках.
Устройство вирусологической лаборатории.
Для организации диагностической лаборатории используют изолированный отсек, состоящий не менее чем из 5-6 комнат.
Под лабораторию отводят светлое помещение. Комнаты для работы с вирусным материалом должны быть хорошо освещены и состоять из предбоксника и бокса, разделенных стеклянной перегородкой с дверьми. В боксах размещают только столы, стулья и принадлежности для работы. Поверхность столов покрывают нержавеющей сталью, пластиком или стеклом, а над рабочей поверхностью устанавливают бактерицидные лампы. У входа в бокс кладут резиновый губчатый дезковрик, пропитанный дезраствором. В предбокснике лежат стерильная одежда и оборудование, соответствующее назначению бокса. Лабораторию обеспечивают холодной и горячей водой и вентиляцией с подачей стерильного воздуха.
Для регистрации поступающего патматериала предназначена приемная, где размещают несколько столов, обитых оцинкованной жестью, и емкости с дезрастворами (3% хлорамина, натрия гидроксида или 5% фенола).
В комнате для предварительной обработки материала (вскрывочной ) вскрывают трупы и отбирают материал для дальнейшего исследования.
Комнаты-боксы оборудуют в зависимости от назначения.
В автоклавной стерилизуют посуду, питательные среды, аппаратуру, питательные среды и обезвреживают инфекционный материал. Необходимо иметь два автоклава: для чистых материалов и для инфицированных.
Моечная предназначена для мытья посуды, аппаратуры и приборов.
Виварий должен иметь карантинное отделение, комнаты для здоровых и экспериментальных животных и подсобные помещения.
Для вирусологической лаборатории любого типа обязательной частью лаборатории является настольный бокс или лучше бокс с ламинарной подачей воздуха.
Когда-то на биофаке ходила легенда, что в лаборатории 4ого уровня безопасности в СССР недосчитались 2-х «пробирок» с опасным инфекционным заболеванием. Пытались найти человека, который с ними работал, но он уехал в отпуск. Паника продолжала нарастать и достигла своего апогея, когда директору позвонили из Ялты и сказали, что у нас тут труп вашего сотрудника, пожалуйста, приезжайте за ним. Ответ директора был короткий и логичный: «Мы к вам не поедем, и Вы, пожалуйста, тоже к нам не приезжайте». Говорят, что в уме он прикидывал расстояние до Ялты. Позже выяснилось, что сотрудник очень торопился и забыл отметить, что образцы были утилизированы, а в Ялте он, к сожалению, утонул. Вспышка опасной болезни была остановлена:) .
Но все-таки интересно, как выглядят лаборатории, в которых хранятся и изучаются самые опасные заболевания. В международной практике существует 4 уровня лабораторий для работы с биологическими патогенами. Все мы знаем значок Biohazard или биологической опасности.
Однако, далеко не всегда то, что хранится за ним опасно для нашей жизни. Это могут быть любые биологические клетки или субстанции, которые потенциально могут воздействовать на живые организмы. Поверьте, если за дверью скрываются действительно опасные объекты, туда просто так не зайти.
Начну по порядку. Самые простые и неопасные - это лаборатории 1го уровня. В них работают с культурами клеток, вирусами и бактериями, которые считаются неинфекционными. Они не должны быть отделены от основного здания, и работники применяют простые средства защиты: халат, перчатки и частичная защита лица.
2ой уровень защиты в целом похож на 1ый, но там уже должен быть ограниченный доступ во время работы, и все манипуляции проводятся в специальных ламинарах. В таких лабораториях изучают инфекции, которые вызывают слабые заболеваниями, а также те, которые точно не передаются воздушно-капельным путем. Например, это некоторые гепатиты, обычные штаммы гриппа, сальмонелла.
На 3ем уровне становится интереснее. Тут уже строгое ограничение на доступ, вход в лабораторию с двойными дверями и тамбуром, это позволяет ограничить обмен воздухом между помещениями. Когда в лаборатории кто-то работает, то в нее не могут попасть другие люди. Вы, наверное, видели в фильмах, что другие сотрудники обычно стучат в дверь, чтобы тот, кто находится внутри им открыл. Это вовсе не означает, что у человека снаружи нет доступа, просто во время исследований, никто не должен туда проходить, вот они и стучат, пытаясь изобразить кота Шрека, чтобы их пустили. Все перемещения патогенов регламентированы и должны проводится только в специальных ламинарах. Воздух проходит обработку и не должен смешиваться поступать в вентиляцию основного здания. Одежды на сотрудниках становится больше (как правило, лицо, голова и руки должны быть закрыты максимально, а халаты не имеют пуговиц спереди, а только завязки сзади). После работы одежда подвергается обработке, но, все-таки, это пока еще не костюм индивидуальной защиты. В таких лаборатория уже можно найти смертельно-опасные заболевания, против которых есть вакцины или эффективное лекарство. Например, желтая лихорадка, западно-нильский вирус и возбудители туберкулеза.
4 уровень предназначен для работы с самыми опасными и заразными вирусами и бактериями, против которых не существует лечения. ВОЗ описывает их дизайн, как чрезвычайно сложный и, поэтому избегает давать какие-либо схемы.Сегодня в них содержатся, в основном, разнообразные геморрагические лихорадки, в том числе Эбола и вирус Марбурга. Вот тут уже появляются полностью герметичные костюмы индивидуальной защиты с избыточным давлением (поэтому люди выглядят как надутые резиновые игрушки). Избыточное давление нужно, чтобы в случае повреждения, воздух устремился из костюма и препятствовал попаданию воздуха из лаборатории в костюм. В самой же лаборатории наоборот поддерживается немного пониженное давление, чтобы в случае разгерметизации комнаты воздух ее не покидал.
Существуют и дополнительные правила работы, например, в таких лабораториях запрещается в одиночку, присутствие напарника обязательно. Начиная с лаборатории третьего уровня каждый сотрудник должен носить с собой специальную карточку-памятку в которой указаны телефоны тех, кому он должен позвонить в случае подозрительных симптомов, а так же указания для лечащего врача. Если вы решили пообщаться с кем-то вне лаборатории, от для этого придется использовать специальную связь - докричаться, увы, не получится.
Переодевание - целый ритуал в лабораториях высокого уровня безопасности. Как и в лабораториях 3его уровня вся одежда полностью снимается и после душа надевается что-то вроде костюма медперсонала. Одна из забавных деталей во время переодевания в спецодежду - это заклеивание скотчем границы между носками-штанами и перчатками-рукавами, кстати, штаны заправляются в носки (прямо бэтменом можно себя почувствовать). После скотча надевается сам герметичный костюм и подключается к источнику воздуха. В фильмах, где показываются подобные лаборатории, иногда видно, что от костюма к потолку тянется спирально закрученный шланг, собственно через него и поступает воздух в костюм. Самое сложное во время работы - не запутаться в этом шланге, как обычно это происходит с пылесосом подключенном к сети. Только вот цена ошибки другая.
Чтобы попасть в эту лабораторию, нужно пройти все семь кругов ада уровни защиты: многочисленные души, вакуумную комнату, облучение ультрафиолетом и все то, на что хватит фантазии разработчика (это одна из немногих профессий, где паранойя приветствуется). Говорят, что высший пилотаж, это когда нужно поднырнуть под стену через бассейн. Современные костюмы достаточно удобны для манипуляций, но в любом случае надо тренироваться, так как даже такое простое действие как сесть на стул может вызвать затруднение - ведь вы плохо чувствует, что происходит вокруг. Но есть еще одно важное неудобство, прежде чем войти в лабораторию (а, как видите процесс это не такой уж и просто), нужно хорошенько подумать, ведь в помещениях 4ого уровня защиты нет туалетов … , так что придётся терпеть до конца эксперимента:) (от питья водички, видимо, лучше тоже воздержаться).
После работы нужно вместе с костюмом пройти через химический душ, чтобы уничтожить все образцы (душ займет несколько минут, так что, если кто-то все-таки не удержался и попил водички до, то эти минуты могут показаться вечностью:)). Далее обычный душ и переодевание в гражданскую одежду.
В качестве примера подобной лаборатории хочу привести инфографику западных иллюстраторов :
Интересен и план действия на разные внештатные ситуации. Например, случае разгерметизации в вентиляцию начинают поступать агенты, которые должны деактивировать любые патогены. Как правило, это достаточно агрессивные соединения, например перекись водорода и формальдегид, поэтому материалы, из которого построено здание должны быть устойчивы к ним (дерево и цветастые обои тут не подойдут, но стильные решения все-таки можно найти).
По понятным причинам в такие лаборатории журналистов и сочувствующих им не пускают, поэтому увидеть лабораторию изнутри практически невозможно. Однако, в Бостоне до начала эксплуатации новой лаборатории 4ого уровня, по ней провели экскурсию и рассказали какие меры предосторожности в ней применяются. Увидеть этот удивительный тур можно на видео, но, к сожалению, оно на английском.
Лабораторий 4ого уровня не так уж и много. На сколько мне известно, в США их пятнадцать, а в России есть только одна, это «Вектор» в Кольцово (Новосибирск). Ее уникальность в том, что только в двух лабораториях в мире: в «Векторе» и в Центре по контролю и профилактике заболеваний США хранятся штаммы натуральной оспы. Периодически поднимается вопрос об их полном уничтожении, но до сих пор финальное решение не принято.
Несмотря на страх людей перед вирусами и бактериями, который бережно культивируется телевидением, они не так уж ужасны, как принято думать. Наши страхи рождаются не вирусами, а незнанием. Сколько людей отказывались просто общаться с ВИЧ-инфицированными, хотя это абсолютно безопасно. Самое главное - следовать рекомендациям и инструкциям. Все заражения, которые происходят в подобных лабораториях, являются не следствием ошибки системы или компьютера, а результатом человеческой халатности. Поэтому внимательно читайте и слушайте инструкции по безопасности, и с вами все будет хорошо:).
Все интересующиеся тематикой могут заглянуть в :)
Направления деятельности
Направление научной деятельности – инфекционная вирусология и эпидемиология, проблемы вирусных инфекций человека и лабораторных приматов, вирусные гепатиты различной этиологии; разработка моделей наиболее значимых вирусных инфекций человека на лабораторных приматах для изучения нерешенных вопросов патогенеза и иммуногенеза, испытания разрабатываемых средств профилактики и лечения.
Задачи и функции
Работа лаборатории складывается из научно-исследовательского и научно-практического разделов.
Основными задачами научно-исследовательской работы лаборатории являются:
1) Изучение спонтанных вирусных инфекций обезьян желудочно-кишечного и респираторного тракта в сравнительном аспекте с аналогичными инфекциями человека.
2) Изучение специфических маркеров вирусных гепатитов А, Е, С, G у обезьян.
3) Изучение характеристик штаммов вирусных агентов, выделенных от обезьян.
4) Изучение роли рота-, адено-, энтеро-, норо- и других кишечных вирусов в патологии желудочно-кишечного тракта лабораторных приматов. Молекулярно-генетическое изучение штаммов.
5) Изучение эпизоотологических и эпидемиологические аспектов спонтанных вирусных инфекций обезьян.
6) Изучение особенностей формирования гуморального иммунитета при спонтанных гепатитах и других вирусных инфекциях обезьян.
7) Изучение распространенности гепатита Е среди обезьян и населения на неэндемичной территории Юга России (регион Большого Сочи).
8) Изучение противокоревого иммунитета у обезьян Адлерского приматологического центра и населения окружающего региона.
9) Изучение диагностической ценности различных методов и диагностических тест-систем при вирусных инфекциях обезьян.
10) Моделирование на обезьянах вирусных заболеваний человека с целью дальнейшего использования разработанных моделей для изучения вопросов патогенеза, иммунитета, методов лечения и профилактики этих заболеваний.
Научно-производственная функция заключается в следующем:
1) специфическая диагностика вирусных инфекций при возникновении вспышек заболеваний неустановленной этиологии.
2) осуществление серологического и генетического мониторинга вирусных инфекций среди лабораторных приматов и населения окружающего региона с целью эпидемиологического надзора.
Темы исследований
1. Кишечные вирусы лабораторных приматов (2010-2012 гг.). Руководитель и ответственный исполнитель работы: зав. лаб., д.м.н. Корзая Л.И. Исполнители: н.с. Кебурия В.В., м.н.с. Гончаренко А.М.
2. Изучение противокоревого иммунитета у обезьян Адлерского приматологического центра и населения окружающего региона (2013-2014 гг.) Научный руководитель и ответственный исполнитель: зав. лаб., д.м.н., Корзая Л.И.
3. Характеристика штаммов ротавируса лабораторных приматов (2013 – 2015 гг.) Руководитель: Л.И. Корзая. Ответственный исполнитель: Д.И. Догадов.
4. Молекулярно-генетическая характеристика кишечных вирусов, циркулирующих среди обезьян Адлерского приматологического центра (2015-2017 гг.). Руководитель работы и ответственный исполнитель: зав. лаб., д.м.н. Корзая Л.И. Л.И. Исполнители: м.н.с. Догадов Д.И., н.с. Кебурия В.В., м.н.с. Гончаренко А.М.
5. Изучение распространения респираторных вирусов человека среди лабораторных приматов.(2016-2018 гг.). Руководитель и ответственный исполнитель работы: зав. лаб., д.м.н. Корзая Л.И. Исполнители: н.с. Кебурия В.В., м.н.с. Гончаренко А.М.
Результаты
Всесторонне изучен спонтанный и экспериментальный гепатит А у нескольких видов низших обезьян Старого Света (З.В.Шевцова, Л.И. Корзая). Установлено, что по серологическим, вирусологическим, биохимическим и морфологическим проявлениям гепатит А не отличается от одноименного заболевания человека. Установлен новый факт хронизации и длительной персистенции вируса. Спонтанный и экспериментальный гепатит А предложены в качестве модели для изучения аналогичной инфекции человека.
Обнаружено новое явление в инфекционной патологии низших обезьян Старого Света - естественное инфицирование ВГС-подобным вирусом. Охарактеризована новая ВГС-подобная инфекция у макак резусов. Обнаружены не только серологические, но и вирусологические маркеры инфекции (РНК ВГС). Выявлены особенности показателей гуморального ответа к вирусу в сравнительном аспекте с человеком, которые выражались в большом разнообразии вариантов спектра антител в отношении основ¬ных диагностических белков ВГС, преобладании антител к неструктурным белкам вируса, а также невысокой их реактив¬ности. Маркеры ВГС-подобной инфекции обезьян обнаруживались на протяжении нескольких лет. Инфекция протекает практически бессимптомно, сопровождаясь лишь незначительным подъемом уровня аланин-аминотрансферазы без морфологического поражения печени. Полученные данные представляют не только теоретиче¬ское, но и большое практическое значение и являются базой для дальнейшей разработки экспериментальной модели гепатита С на низших обезьянах.
Впервые получены данные о широкой циркуляции вируса гепатита Е не только среди макак Адлерского питомника, но и среди населения окружающей территории – региона Большого Сочи. Выявление анти-ВГЕ IgM в сыворотках людей свидетельствует о наличии случаев острого ГЕ на неэндемичной по ГЕ территории. Процент обнаружения анти-ВГЕ среди обслуживающего персонала питомника оказался значительно ниже, чем среди населения окружающего региона, что предполагает наличие иного источника ВГЕ-инфекции для человека, нежели обезьяны.
Выявлена инфицированность лабораторных приматов кишечными вирусами (рота-, энтеро-, адено-, ВГА, ВГЕ). Большинство вирусных инфекций протекало бессимптомно, сопровождаясь лишь лабораторными признаками. Показана определенная роль ротавируса, аденовируса и энтеровируса при заболеваниях желудочно-кишечного тракта обезьян, а также вирусоносительство у «клинически» здоровых животных. У погибших обезьян с диареей (макаки резусы) более чем в половине случаев (58,3%) наблюдалась микст-инфекция, ассоциированная с кишечными вирусами. У клинически здоровых животных микст-инфекция обнаруживалась почти в 5 раз реже (12,5%). Показана различная чувствительность коммерческих тест-систем при обнаружении ротавируса и аденовируса в материалах от обезьян. Методы детекции кишечных вирусов (ПЦР, ИФА, РНГА, РТНГА) внедрены в практику лаборатории инфекционной вирусологии для выяснения этиологии диарейных заболеваний у обезьян, что позволит избежать необоснованного применения антибиотиков и других лекарственных препаратов.
Выявлена крайне низкая степень противокоревого иммунитета среди обезьян Адлерского приматологического центра (14,9±1,6% за счет особей старше 22 лет). Показано отсутствие циркуляция вируса кори среди обезьян с 1993 года. Появление источника инфекции среди неиммунных обезьян (85,1%) может привести к возникновению вспышки кори. При обострении эпидемической ситуации по кори предлагается проведение вакцинации серонегативных обезьян.
Получены важные данные при изучении иммуноструктуры к вирусу кори молодого населения г. Сочи (индикаторная группа в возрасте от 18 – до 35 лет). Отсутствие иммунитета к кори у 42,2±7,4% студентов РУДН (18-25 лет) и низкий уровень антител к вирусу у подавляющего большинства остальных лиц этой группы свидетельствует о неблагополучной ситуации по кори среди восприимчивого контингента. Среди сотрудников НИИ МП также зарегистрировано 14,5% серонегативных к вирусу кори лиц, а в возрасте до 35 лет - 22,2%. Наличие серонегативных лиц требует проведения вакцинации против кори.
Научные исследования сотрудников лаборатории инфекционных вирусов с 2002 года поддерживаются грантами Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ) и РФФИ-ЮГ.
В лаборатории проводится подготовка специалистов вирусологов через аспирантуру.
Сотрудники лаборатории осуществляют научно-педагогическую работу в Сочинском филиале Российского университета дружбы народов на кафедрах физиологии, медицинской ветеринарии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Проводится курс лекций и практических занятий по дисциплинам «Вирусология», «Микробиология», «Биологическая безопасность в лабораториях». На базе лаборатории выполняются дипломные работы.
В лаборатории проводятся договорные НИИ по доклиническому испытанию вакцин.
Персонал
- Корзая Лидия Ивановна – зав. лаб., д.м.н.
- Кебурия Виктория Велодиевна – н.с.
- Догадов Дмитрий Игоревич – н.с.
- Гончаренко Александра Михайловна – м.н.с.
Основные публикации
1. Корзая Л.И., Шевцова З.В., Лапин Б.А., Дьяченко А.Г., Крылова Р.И. Получение и характеристика культуральных штаммов вируса гепатита А от человека и обезьян. Вопр. вирусол., 1997, №2, c. 60-63.
2. Корзая Л.И., Лапин Б.А., Шевцова З.В., Крылова Р.И., Эсванджия Н.Ч. Характеристика экспериментальных моделей гепатита А на павианах гамадрилах. Вопр. вирусол., 1998, №2, с.67-70.
3. Корзая Л.И., Шевцова З.В., Лапин Б.А., Крылова Р.И., Джелиева З.Н. Повторная инфекция при гепатите А у макак резусов в эксперименте. Вопр. вирусол., 1998, №4 , с. 158-163.
4. Лапин Б.А., Джикидзе Э.К., Крылова Р.И., Корзая Л.И., Гвоздик Т.Е., Джелиева З.Н., Симаванян К.В., Кукава Г.Г. Спонтанное заболевание обезьян неизвес¬тной этиологии. Baltic. J. Lab. Anim. Sci., 1999, P.19-28.
5. Korzaya L.I., Lapin B.A., Shevtsova Z.V., Krilova R.I. Spontaneous and experimental hepatitis A in Old World monkeys are the models of human hepatitis A. // J. Lab. Anim. Sci., 2001, 11(2), P. 135-141.
6. Корзая Л.И., Лапин Б.А., Кебурия В.В., Чикобава М.Г. Естественное инфицирование приматов вирусом гепатита С. // Бюл. Экспер. Биол. – 2002. – .Т. 133, № 2. - С. 211-214.
7. Лапин Б.А., Шевцова З.В., Корзая Л.И., Крылова Р.И. Спонтанный и экспериментальный гепатит А у низших обезьян Старого Света и их использование для изучения этой инфекции. // Мир вирусных гепатитов. - 2006. - №6. - С. 3-9.
8. Корзая Л.И., Кебурия В.В., Лазарева И.Я., Лапин Б.А. Вирусные гепатиты (А, Е) у лабораторных приматов. Эпидемиологические аспекты проблемы. // В кн.: Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах. Материалы международной научной конференции. 19-22 сентября 2007 года, Сочи-Адлер. – 2007. - С. 94-103.
9. Кебурия В.В., Корзая Л.И., Крылова Р.И., Лапин Б.А. Длительное динамическое наблюдение за HCV-позитивными макаками Адлерского приматологического центра. // В кн.: Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах. Материалы международной научной конференции. 19-22 сентября 2007 года, Сочи-Адлер. – 2007. - С. 132-141.
10. Корзая Л.И., Лапин Б.А., Кебурия В.В., Лазарева И.Я. Частота выявления антител к вирусу гепатита Е у обслуживающего персонала и у макак Адлерского питомника. // Вопр. вирусол. – 2007. - С. 36-40.
11. Корзая Л.И., Кебурия В.В., Лазарева И.Я, Лапин Б.А. Частота распространения антител к вирусу гепатита Е среди населения Адлерского региона и обезьян приматологического центра. // В кн.: Вирусные гепатиты – эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика. Материалы YII Российской научно-практической конференции с международным участием. 29-31 мая 2007 г., Москва. – С. 113-114.
12. Корзая Л.И., Кебурия В.В., Лазарева И.Я. Анализ обнаружения маркеров гепатита Е у обезьян Адлерского питомника. // В кн.: Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края. Конференция грантодержателей регионального конкурса Российского фонда фундаментальных исследований и администрации Краснодарского края “ЮГ РОССИИ”. Сборник тезисов. – Краснодар 2007. – С. 146-148.
13. Кебурия В.В., Корзая Л.И. Спонтанная HCV- подобная инфекция лабораторных приматов. // Материалы Y научно-практической конференции молодых ученых и студентов юга России. «Медицинская наука и здравоохранение». Краснодар 2007. – С. 37-40.
14. Корзая Л.И., Кебурия В.В., Гончаренко А.М. Маркеры энтеральных гепатитов Е и А у населения Адлерского региона и обезьян приматологического центра. // Тезисы Четвертой международной конферкнции, посвященной 85-летию Санкт- Петербургского НИИЭМ Пастера и 120-летию Парижского института Пастера. Санкт-Петербург, 2-4 июня 2008. С. 32.
15. Корзая Л.И., Кебурия В.В., Лазарева И.Я., Гончаренко А.М. Анализ обнаружения маркеров гепатита Е у обезьян Адлерского питомника. // В кн.: Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края. Конференция грантодержателей регионального конкурса Российского фонда фундаментальных исследований и администрации Краснодарского края “ЮГ РОССИИ”. Сборник тезисов. – Краснодар 2008. – С.56.
16. Корзая Л.И., Кебурия В.В., Гончаренко А.М., Лапин Б.А. Эпидемиологические аспекты изучения вирусного гепатита Е человека и лабораторных приматов. // Материалы II Ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням. – Москва, 29-31 марта 2011 г. С. 154.
17. Корзая Л.И., Кебурия В.В., Гончаренко А.М., Лапин Б.А. Молекулярная диагностика энтеровирусных инфекций у обезьян. // В сб. трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010». – Москва, 24-26 ноября 2010 г.,
Научные работы за 5 лет
1. Корзая Л.И., Кебурия В.В., Гончаренко А.М., Догадов Д.И., Лапин Б.А. Маркеры вирусных инфекций у лабораторных приматов. //В кн.: Фундаментальные и прикладные аспекты медицинской приматологии. Материалы второй международной научной конференции. Том 1. (8-10 августа 2011 года, Сочи-Адлер). – 2011. - С. 79-88.
2. Кебурия В.В., Корзая Л.И., Гончаренко А.М., Гвоздик Т.Е. Изучение роли вирусных агентов в патологии желудочно-кишечного тракта обезьян. //В кн.: Фундаментальные и прикладные аспекты медицинской приматологии. Материалы второй международной научной конференции. Том 1. (8-10 августа 2011 года, Сочи-Адлер). – 2011. - С. 216-221.
3. Корзая Л.И., Кебурия В.В., Догадов Д.И., Лапин Б.А. Энтеральные вирусные инфекции лабораторных приматов. // Материалы IY Ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням. – Москва, 26-28 марта 2012 г., С.186.
4. Корзая Л.И., Догадов Д.И., Кебурия В.В., Лапин Б.А. Ротавирусы лабораторных приматов. Материалы V Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням, 25-27 марта 2013 г. Москва, с. 208-209.
5. Догадов Д.И., Корзая Л.И., Кебурия В.В. Определение аденовирусов у лабораторных приматов методом полимеразной цепной реакции. Материалы V Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням, 25-27 марта 2013 г. Москва, с. 129.
6. Корзая Л.И., Кебурия В.В., Догадов Д.И., Лапин Б.А.Сравнительное изучение серологических маркеров энтеральных вирусных гепатитов у макак резусов (Macaca mulatta). // Материалы VI Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням, 24-26 марта 2014 г. Москва, с. 146.
7. Корзая Л.И., Догадов Д.И., Кебурия В.В., Лапин Б.А. Изучение эпидемиологических аспектов кори на модели естественной инфекции лабораторных приматов. // Материалы VI Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням, 24-26 марта 2014 г. Москва, с. 146-147.
8. Догадов Д.И., Корзая Л.И., Кебурия В.В. Молекулярно-генетические маркеры кишечных вирусных инфекций лабораторных приматов. //В сб. трудов YIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. – Москва, 2014. - Том I. – С.385.
9. Лапин Б.А., Джикидзе Э.К., Яковлева Л.А., Еорова Т.П., Корзая Л.И. Болезни обезьян, опасные для человека. Правила содержания и работы с обезьянами в карантине при поступлении животных из внешних источников, а также при экспериментальном инфицировании.// Методические рекомендации – М. – 2014. С. 52.
10. Догадов Д.И., Корзая Л.И., Кебурия В.В. Молекулярно-генетические маркеры кишечных вирусных инфекций лабораторных приматов. //В сб. трудов YIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. – Москва, 2014. - Том I. – С.385.
11. Догадов Д.И., Корзая Л.И., Кюрегян К.К., Карлсен А.А. Выявление вируса гепатита А у зеленых мартышек (CHLOROCEBUS PYGERYTHRUS), прибывших из мест естественного обитания (Танзания). // Медицинская вирусология, том ХХIХ (2). Приложение. Материалы конференции, посвященной 60-летнему юбилею Института полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова. (8-9 декабря 2015 года). Москва, 2015. С. 84.
12. Корзая Л.И., Кебурия В.В., Догадов Д.И., Лапи Б.А., Кюрегян К.К., Михайлов М.И.Маркеры гепатита Е у населения Большого Сочи и обезьян Адлерского приматологического центра. // Вопр. вирусол, 2015 (принята к печати!)
У нас есть собственная национальная специализированная коллекция бактерий и вирусов. Ученые десятилетиями кропотливо собирали образцы со всего мира. Ради чего?
Проходя мимо государственного учреждения “Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии” Министерства здравоохранения, расположенного на минской улице Филимонова, многие даже не подозревают, что веселенькой сине-голубой окраски корпус на самом деле является практически неприступной крепостью. Именно здесь хранится национальная коллекция вирусов и бактерий, множество из которых могут с легкостью убить человека и вызвать эпидемию мирового масштаба.
Я у входа в здание. На меня в упор смотрят фасадные видеокамеры. Руки в карманы, вразвалочку прохожу по вестибюлю, гадая, так ли строго охраняются страшные экспонаты коллекции. Разумеется, проводить диверсию я не намерен, но любопытно.
Чтобы попасть на территорию Коллекции, нужно открыть дверь с помощью электронной карты. И зайти получится лишь в небольшой тамбур. Дверь с тревожной надписью “Опасная зона” и говорящим ядовито-желтым значком биологической угрозы - следующий уровень защиты.
Далее по широкому коридору - комната наблюдения. Здесь постоянно дежурит персонал. На монитор выведены картинки с внутренних камер. Сколько их? Десять? Двадцать? Во-первых, эта мера позволит выявить непрошеного гостя, если такой и появится в стенах здания. Хотя такое полностью исключено.
Во-вторых, поможет максимально быстро отреагировать, если сотруднику в одном из лабораторных помещений понадобится помощь.
Через толстое двухслойное стекло заглядываю в очередное помещение. Мощнейшие микроскопы с выводом картинки на мониторы компьютеров. Ряды пробирок и колб, биксы с инструментами. Дверь цельнометаллическая. Не взломаешь, не пробьешь. А вот на электронную карточку Ларисы Михайловны преграда отзывается тихим щелчком. Провожатая поясняет, что она - одна из очень немногих, кому разрешен доступ во все помещения центра. Большинство же сотрудников имеют доступы лишь в ограниченное их количество.
Работа с инфекционным материалом - опасными вирусами и бактериями - проводится в лабораторных помещениях так называемой заразной зоны, которая отделена от “чистой зоны” санпропускником. Через окно в коридоре заглядываю в ядро центра, где между лаборантом и вирусом происходит контакт.
Впрочем, таких знакомых по фильмам-катастрофам силуэтов в скафандрах я не замечаю. Люди одеты в рабочие халаты, в обычных медицинских перчатках и легких респираторах. От страшной смерти их отделяет стекло и металл боксов. Именно там, в этих коробах, через толстые встроенные перчатки и манипуляторы ставят эксперименты над опасными вирусами.
До сих пор никаких происшествий не случалось. Однако исключать вероятность ни в коем случае нельзя. Поэтому каждый сотрудник проходит специальную подготовку по соблюдению правил работы с инфекционным материалом и аттестацию для получения допуска к работе, который утверждает директор центра. Среди вопросов тестирования есть и такой: “Как следует поступать в случае если в помещении разбился флакон с вирусом?” Единственный правильный ответ: “Этого не может быть”.
Я недоумеваю. Воспитанный, по большому счету, на голливудских фильмах про всяческие зомби-апокалипсисы и глобальные эпидемии, я четко знаю: все беды мирового масштаба начинаются с того, что нерадивый лаборант спотыкается и роняет хрупкий сосуд с содержимым. Обязательно на металлическую поверхность или аккурат на уголок стола. Звонкое “бзынь”, легкое облачко тумана, брызги жидкости, камера крупным планом показывает решетку вентиляции. Сирены, мигающий свет, крики о помощи... Все в таком духе.
В реальности в нашей стране никто не работает с вирусами первой и второй группы патогенности (самые агрессивные из четырех существующих) так, чтобы была возможность что-то разбить или сломать.
Как емкость с плененным вирусом доставляется в центр? Лариса Рустамова демонстрирует небольшой металлический контейнер. Открывает плотно пригнанную крышку. Внутри - емкости с хладагентом, между которыми зажат пластиковый футляр. И только в нем - жестко зафиксированный флакон. Прямо как в сказке: в зайце - утка, в утке - яйцо, в яйце - игла, а на конце ее - смерть... Правда, в моем случае вся эта “капуста” содержит пустую пробирку. А вот “одежки” со смертоносной начинкой “снимаются” лишь в боксах, перед защитными системами которых пасует даже самая злобная и всепроникающая хворь.
Во всех внутренних помещениях, за герметичными дверями, поддерживается особый режим вентиляции, в боксах - отрицательное давление. Предположим самый плохой вариант: флакон со страшным содержимым в защитной линии разбит вдребезги. В этом случае воздух, попутно прихватив вирус, со свистом потянется в вентиляционные каналы. А там - сложная система фильтров тонкой очистки, которые улавливают частицы вируса.
Разумеется, вентиляция выйти из строя не может?
На случай отключения электроэнергии даже в масштабах города у нас предусмотрен автономный электрогенератор, который подключается автоматически.
В наше время происходит всеобщая глобализация. Границы между странами стираются, туристы колесят по всему миру, привозя с собой самые разные заболевания. Именно по этой причине в морозильных камерах центра наравне с вирусами и бактериями, выделенными на территории страны (гриппом, клещевым энцефалитом, гепатитом) хранятся и особо опасные возбудители геморрагических лихорадок. Есть Эбола, вызывающая в 90 процентах случаев летальный исход пораженного, и не менее коварный вирус Ласса - возбудитель тяжелейшей геморрагической лихорадки. В коллекции также вирус Марбург, впервые выделенный в Германии и в свое время унесший жизни большого количества людей. О вирусе Зика сегодня знают все. Ученые центра его пленили и стали изучать еще во времена СССР.
Никто не может гарантировать, что в один прекрасный момент чума, оспа, когда-то погубившие миллионы людей, а нынче исчезнувшие, не появятся вновь. Именно по этой причине в центре эпидемиологии и микробиологии ученые хранят даже “списанные” самой природой вирусы и бактерии.
Кратко о моральном аспекте. За несколько дней до моего прихода в лабораториях центра как раз закончили исследования с опасными вирусами на лабораторных животных. Подопытными традиционно стали мыши, морские свинки.
Как вы можете спокойно смотреть в глаза зверушкам, львиную долю которых сознательно обрекаете на смерть? - провоцирую собеседницу.
Разумеется, искренне жаль, что приходится проводить такие эксперименты. Но, извините, речь идет о здоровье человека, о существовании нации в целом. Представьте, вы видите перед собой заболевшего ребенка, которому не можете помочь лишь потому, что в свое время задались вопросом: “А как бы мне побольше мышей сохранить?”. Приоритеты нужно расставлять правильно.
Лаборатории микробиологического профиля входят в состав центров госанэпиднадзора (ЦГСЭН), инфекционных и крупных больниц, кожно-венерологических и туберкулезных диспансеров. В зависимости от ведомственной принадлежности, в бактериологических, вирусологических, микологических и пр. лабораториях проводится диагностическая работа, которая регламентируется соответствующими инструкциями и законодательствами. В соответствии с этими актами законодательств, каждая из лабораторий может работать только с определенными группами микроорганизмов.
Бактериологические лаборатории ЦГСЭН работают с микробами III и 1У групп, проводя этиологическую диагностику инфекционных заболеваний воздушно-капельного, кишечного, гнойно-воспалительного и пр. характера.
Вирусологические лаборатории проводят вирусологическую диагностику заболеваний, вызванных вирусами (грипп, полиомиэлит, герпес и др.), а также - хламидиями (орнитоз, мочеполовые заболевания и пр.) и риккетсиями (Ку-лихорадка, сыпной тиф и пр.).
Лаборатории особо-опасных инфекций проводят диагностику особо-опасных инфекций микробной (чума, холера, сибирская язва, бруцеллез, туляремия и др.), а некоторые из них и вирусной этиологии (Марбург, Эбола, натуральная оспа и др.). Работа проводится по особо строгим регламентациям.
Кожно-венерологическая группа заболеваний и туберкулез диагносцируется в соответствующих диспансерах.
Бактериологические лаборатории ЦГСЭН должны размещаться в типовых зданиях или помещениях, рассчитаных на проводимый объем работы, соответственно назначению. В каждой баклаборатории должен быть предусмотрен полный набор необходимых для них подразделений: регистратура для приема анализов и выдачи результата, боксы для работы с бактериями разных групп, помещение для проведения иммунодиагностических и молекулярно-генетических анализов, помещения для приготовления питательных сред, стерилизации, мойки, возможен виварий с боксами для здоровых и подопытных животных.
Каждое помещение оборудовано соответствующим оборудованием и аппаратурой.
В стерилизационной должен находится стерилизатор паровой, определенной модели - вертикальный или горизонтальный и пр.
Из оборудования для выращивания, хранения микроорганизмов и другой работы необходимо иметь:
Холодильники, для раздельного хранения культур и других биологических препаратов, согласно инструкции.
Центрифуги, для осаждения корпускулярных веществ, в том числе - микроорганизмов. Центрифуги должны иметь охлаждение.
Термостаты, для выращивания культур бактерий при заданной температуре.
Микранаэростаты, для выращивания в бескислородных условиях бактерий, называемых анаэробами.
Дистиллятор, для получения дистиллированной воды.
Аппарат для изготовления ватно-марлевых пробок разных размеров.
В боксовых комнатах необходимо иметь: биологические иммерсионные микроскопы (к ним - осветитель фазово-контрастного устройства, конденсор темнопольный), водяные бани, холодильники, набор инструментов (бактериологические петли, иглы, скальпели, пинцеты, шпатели и пр.), наборы красителей, спирт, реактивы, фильтровальная бумага, карандаши для надписей по стеклу, кислоты, щелочи, спиртовки и газовые горелки. Банки с дез.раствором (подписанные, с датой приготовления данного дез.раствора). Лабораторная посуда: пипетки, пробирки, колбы, флаконы, чашки Петри, матрацы, пастерки и пр.
Лаборатория должна иметь определенный запас коммерческих питательных сред, тест- систем и сывороток диагностических, разнообразных наборов диагностических препаратов.
Некоторые правила работы в микробиологических лабораториях:
1. Все сотрудники работают в медицинских халатах, шапочке, тапочках. В случае необходимости надевают маску.
2. В лаборатории запрещается курить, принимать пищу, пить воду, за исключением, в специально отведенных местах.
3. Рабочее место содержится в образцовом порядке.
4. При попадании инфицированного материала на стол, пол или иную поверхность, необходимо обработать это место дезинфицирующим раствором.
5. Хранение, пересылка, выдача культур микроорганизмов производится согласно предписанию.
6. По окончанию работы руки тщательно моют с мылом. При необходимости руки можно обработать одним из дез.растворов и пр.
Вирусологические лаборатории. Они должны быть полностью изолированными от других подразделений. В структуре вирусологических лабораторий имеются определенные различия, в зависимости от специализации, но есть основные подразделения: морозильнаякамера, мойка, дезинфекционная, чистых культур клеток и зараженных, боксы для работы с вирусами, комната для иммунодиагностических исследований, виварий, комната для куриных эмбрионов – чистых и зараженых.
Вирусологическая лаборатория должна иметь: раздевалку - для смены одежды, обуви, кафельные полы, покрытые линолиумом. Затянутые сеткой окна. Ультрафиолетовые лампы. Необходимы холодильники - на 4 о С и ультрахолодильник на -20-40 о С и более, фарфоровые ступки, гомогенизаторы, пестики, нструментарий (ножницы, иглы, шприцы, скальпели, пинцеты и пр.). Центрифуги с охлаждением до 5-6 тыс об. и ультрацентрифуги до 30 тыс. об. в мин и более. Люминисцентный микроскоп. Инкубаторы на 37 о С, с целью содержания в них куриных эмбрионов и нструментария для работы с ними. Термостаты с автоматическим параметрами, для инкубирования зараженных куриных эмбрионов. Стеклянная посуда и штативы для пробирок, горелки и пр.
Некоторые правила работы в вирусологических лабораториях:
1. Вход в вирусологическую лабораторию разрешен только работникам. Переодевание обязательно в специальную одежду, согласно с выполняемой работой (халат, колпак, обувь).
2. Перед входом обязательно иметь коврик, смоченный дез.раствором.
3. Все виды работ с зараженным или предпологаемым на заражение материалом следует проводить строго в соответствии с инструкцией.
4. Работа в боксах обязательна с дополнительными атрибутами в одежде:маска, двойной халат, перчатки, полотенце, защитные очки и пр.
6. В случае «аварии» (разбрызгивание вируссодержащего материала) следует вызвать заведующего или другого врача (не выходя из бокса, нажав на кнопку звонка) и провести вдвоем обеззараживание согласно инструкции.
7. В нобходимых случаях проходить вакцинацию, согласно инструкции.
8. Отработанный вируссодержащий материал уничтожают автоклавированием при 1,5 атм в течение 30 мин.
9. После завершения работы следует переодеться в предбокснике в обычный халат и обувь, колпак или косынку, вымыть руки с мылом, при необходимости продезинфицировать.
10. Боксы перед работой обрабатывают парами формалина, ультрафиолетовым светом. После работы обрабатывают 2 % раствором хлорамина и др.
Правила работы студентов на кафедре микробиологии и вирусологии:
1. Обязанности дежурных:
Вместе с лаборантом проверить наличие и количество инструментария (бактериальные петли, пинцеты и пр.), материала, предназначенного для занятий (пробирки и чашки с посевами, карандашей для надписей по стеклу, бумажек с генцианвиолетом, красителей и пр.), состояние микроскопов, предметных и покровных стекол и пр. Сделать записи в соответствующий журнал для дежурных. Принять учебный материал от лаборанта и раздать студентам. Принять поштучно чашки и пробирки с посевами микроорганизмов.
По окончанию занятий дежурный проверяет состояние рабочих столов, устраняет все дефекты их уборки, проверяет наличие инструментария, микроскопов и пр. Пробирки и чашки с посевами поштучно сдает лаборанту, заполняет тетрадь дежурного, сдает комнату лаборанту, выключает свет.
2. Обязанности студентов:
Перед началом работы . Надеть медицинский халат, застегнуть его, надеть шапочку или косынку. Портфели и книги положить в ящик стола или в пакеты. Проверить состояние рабочего стола и микроскопа. На рабочий стол положить тетрадь, ручку, карандаши, в том числе – цветные.
Во время работы . Бережно обращаться с микроскопом, посудой, инструментарием и пр. Внимательно относиться ко всем этапам работы с культурами бактерий. Подписывать посуду с микробами. Стерилизовать петлю по окончанию работы с культурами. При аварии (загрязнения заразным материалом поверхности стола, пола, одежды, кожи и пр.) сообщить о случившемся преподавателю и совместно устранить загрязнение.
После работы . Привести в порядок рабочее место. Засеянные чашки, пробирки сдать дежурному. Отработанный материал сдать дежурному. Все использованные инструменты следует прожечь над огнем спиртовки, стекла опустить в банки с дез.раствором. Привести в порядок микроскоп и рабочий стол. Тщательно вымыть руки с мылом.
Входить и работать в учебных комнатах без халата или колпачка. Принимать пищу в помещениях кафедры. Курить, сорить. Класть на стол и подоконники портфели, шапки, учебники. Портить оборудование. Пачкать столы. Громко разговаривать и смеяться, бегать и мешать в работе кафедры.
